05/04/2016 ИХБФМ СО РАН
Биолюминесцентный зонд для определения вирусов
1047 СО РАН ИХБФМ СО РАН ИБФ СО РАН Инновации Науки о жизни Красноярск Новосибирск Ученые из Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН совместно с коллегами из Института биофизики СО РАН (г. Красноярск) создали биосенсор, способный распознавать клещевой энцефалит.
Биолюминесцентный зонд представляет собой рекомбинантный белок, состоящий из двух частей. Одна связывается с вирусом, а вторая служит сигнальной молекулой, которая и позволяет выявить его наличие. «Первый фрагмент биосенсора - это вариабельный домен специфичных моноклональных антител, который контактирует непосредственно с белком вируса, - поясняет старший научный сотрудник ИХБФМ СО РАН кандидат биологических наук Вера Витальевна Морозова. - Второй - люминесцентный белок(люцифераза), полученный в ИБФ».
«Упомянутая люцифераза (в данном случае — мягкого коралла Renilla muelleri) — небольшой одноцепочечный белок, она была клонирована нашей лабораторией фотобиологии, и в нее мы ввели 7 мутаций, в результате которых существенно увеличилась стабильность фермента, - поясняет ведущий научный сотрудник ИБФ СО РАН доктор биологических наук Людмила Алексеевна Франк. Известно, что квантовый выход у биолюминесцентных реакций (катализируемых специфическими ферментами - люциферазами) намного выше, чем у обычных хемилюминесцентных (свечение, сопровождающее некоторые химические процессы - прим.ред.) реакций. То есть, количество света, испускаемое в результате люциферазных реакций больше, и таким образом, люциферазы, используемые как сигнальные молекулы, позволяют выявлять мишени с более высокой чувствительностью. Обе составляющих соединяются с помощью методов генной инженерии, в результате получается плазмида - генетическая конструкция, содержащая объединенные гены двух белков. Затем она помещается в бактериальные клетки, в которых синтезируется гибридный, достаточно стабильный искусственный белок — его можно выделить из клеток и работать с ним далее. «Технически весь процесс тестирования выглядит так: берется клещ, размалывается, из него экстрагируется водная часть, которая, может содержать вирус, далее водная суспензия вносится в ячейки, содержащие антитела, - объясняет младший научный сотрудник ИХБФМ СО РАН кандидат химических наук Иван Константинович Байков. — В случае, когда последние связали вирус клещевого энцефалита, происходит его накопление, что затем выявляется добавлением биолюминисцентного зонда и последующей химической реакцией люминесценции. Если вируса клещевого энцефалита нет, то антитела остаются пустые, сигнала не будет». Выявить клещевой энцефалит в крови сложнее, он присутствует там недолго, а потом проникает в нервную систему, так что основное применение зонда — экспресс-проверка клещей, переносящих заболевание. Если говорить об аппаратной части, то для выполнения анализов необходим люминометр, с помощью которого регистрируются кванты излучения от люциферазной части биосенсора.
Ученые проверили клещей, предварительно зараженных вирусом с определенным титром одновременно в коммерческих тест-системах и с помощью созданного зонда. «Преимущество этой разработки — более высокая чувствительность, она позволяет выявить даже незначительное количество вируса клещевого энцефалита, — отмечает Иван Байков. — Для внедрения в практику нам нужно провести еще ряд экспериментов, выявить, какие примеси могут мешать, оптимизировать протокол пробоподготовки и непосредственно прототип тест-системы». По такому же принципу можно разрабатывать зонды и для детекции других вирусов: точно так же взять нужное антитело и объединить по уже известной технологии с биолюминисцентным белком. «Это касается и бактериальных или грибных агентов, — комментирует Вера Морозова. — Сейчас мы пытаемся получить тест-системы на выявление патогенных грибов, часто встречающихся у иммуносупрессивных пациентов».